实验科普： RNA反转录

一、RNA模板制备

RNA是反转录的模板。总RNA通常用于RT-(q)PCR等下游应用的cDNA合成，而特定类型的RNA（如信使RNA（mRNA）、miRNA等小RNA）可通过富集而用于某些实验应用，如cDNA文库构建和miRNA图谱分析。

保持RNA的完整性至关重要，在提取、处理、储存和实验过程中均需要采取特殊的保护措施。防止RNA降解的最佳方法包括佩戴手套、使用具有气溶胶屏障的移液器移液、使用无核酸酶的实验室器具和试剂以及对实验区域进行去污处理。

根据来源材料（如血液、组织、细胞、植物）的类型和实验目标，有多种RNA分离和纯化方法可供选择。分离纯化过程的主要目标是稳定RNA分子、抑制RNA酶，并通过适当的储存和提取方法最大程度提高产量。最佳的纯化方法可以去除干扰酶活性的内源性化合物，如植物组织中的复合多糖和腐殖酸，以及反转录酶的常见抑制剂，如盐、金属离子、乙醇和苯酚。纯化的RNA应保存在-80°C，尽量减少反复冻融。

纯化后评估RNA质量和数量的方法有许多种。常用的方法是利用紫外光谱法检测特定波长的吸光度。RNA质量可通过利用Beer-Lambert定律测定260 nm处的吸光度而确定；不同波长的吸光度比值可以确定是否存在特定污染物（表1）。请注意，紫外吸光度不是RNA特有的，所有核酸都可以吸收相近波长的紫外线。对于需要更高RNA特异和更灵敏分析的RNA, 可以考虑使用含染料的荧光试剂，这种试剂只在特异性的与目标分子结合时才会释放荧光信号。

以28S和18S核糖体RNA（rRNA）的比值可评估RNA的完整性。将总RNA变性后进行凝胶电泳，可对其进行定性评估。然后，评估28S rRNA与18S rRNA的强度比，比值为2:1代表完整的RNA（图1A）。Agilent Technologies开发的一种方法结合了微流体学和专利算法，可定量评估RNA的完整性。该方法可产生数字读数，称为RNA完整性分数或RIN值，数值介于8至10之间代表高质量的RNA [1,2]（图1B）。

二、基因组DNA的去除

某些情况下，痕量基因组DNA（gDNA）可能与RNA共同被纯化。污染gDNA可能会干扰反转录结果，导致RT-qPCR等高灵敏度实验出现假阳性、高背景或检测率降低。

为去除gDNA，通常在RNA分离过程中加入DNase I。在进行RT-(q)PCR之前，必须完全去除DNase I，因为任何残留的酶都会使单链DNA（如引物和cDNA）降解。通常，DNase I失活（如，EDTA和加热处理）或酶去除步骤会导致RNA降解或样品损失。

作为DNase I的替代品，可使用双链特异性DNase去除污染gDNA，而不影响RNA或单链DNA。它们的热分解性质使其在相对温和的温度（如55℃）下即可失活，同时没有负面影响。在反转录反应之前，只需将这种双链特异性DNase与RNA在37℃下孵育2分钟，从而简化实验流程（图2）。

三、反转录酶选择

反转录酶以RNA为模板合成cDNA，但这一类反转录酶可能具有不同的功能活性和性质。它们的性质会影响其反转录长链RNA、高GC含量RNA、具有复杂二级结构的RNA和不纯RNA的能力。

分子生物学中使用的大多数反转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的pol基因。AMV反转录酶是实验室中首批用于cDNA合成的酶之一。该酶是一种分子量为170-kDa的异二聚体，最佳反应温度范围为42-48℃。AMV反转录酶具有较强的RNase H活性，可降解RNA:cDNA复合物中的RNA，获得的cDNA片段较短（<5 kb）。

MMLV反转录酶因具有单体结构而成为常用的替代品，可对重组酶进行更简单的克隆和修饰。MMLV反转录酶是一种分子量为75 kDa的酶，反应温度约为37°C。虽然MMLV的热稳定性低于AMV反转录酶，但其RNase H活性较低，因此具有更高的长cDNA（<7kb）合成效率[3]。

为了进一步改善cDNA合成，MMLV反转录酶经过改造具有更低的RNase H活性（即RNase H Minus，将RNase H结构域进行突变）、更高的热稳定性（高达55℃）和更强的持续合成能力（65倍以上）。这些属性改变可增加cDNA长度和产量，提高灵敏性，改善抑制剂耐受性，并缩短反应时间（表2）[4]。

四、引物选择

为了启动反转录，反转录酶需要一种短DNA寡核苷酸（即引物）与其互补序列在RNA模板上结合，并作为新链合成的起点。根据RNA模板和下游应用，有三种基本类型的引物可供选用：oligo（dT）引物、随机引物和基因特异性引物（图3）。

❖ Oligo（dT）引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成，可与真核mRNA的poly(A) 尾退火。其为从真核生物mRNA构建cDNA文库、全长cDNA克隆和cDNA 3'末端快速扩增（3'RACE）的最佳选择。由于oligo(dT)引物对poly(A) 尾的特异性，其不适用于降解的RNA，如来自FFPE样品的RNA，也不适用于缺少poly(A) 尾的RNA，如原核生物RNA和microRNA。由于cDNA合成开始于3' poly（A）尾，oligo(dT)引物可能引起3'末端偏差。具有复杂二级结构的RNA也可能影响全长cDNA合成，导致5'末端的代表性偏低。

通过修饰Oligo(dT)引物，可以提高反转录效率。例如，Oligo(dT)引物的长度可以延伸到20个核苷酸或更长，使其在较高温度下退火。在一些情况下，Oligo(dT)引物可能包括3'末端的多义碱基，如dN（dA，dT，dG或dC）和dV（dG，dA或dC）。该修饰可防止poly(A)滑移，并且将起始位点锁定在poly(A)尾的上游位置。这些引物被称为锚定oligo(dT)。

❖ 随机引物是具有随机碱基序列的寡核苷酸，通常由6个核苷酸组成，被称为随机六聚体、N6或dN6。由于随机引物的随机结合（即没有模板特异性），其可以退火到样本中的任何类型RNA。因此，这些引物被认为可以用于无poly（A）尾结构（如rRNA、tRNA、非编码RNA、小RNA、原核mRNA）的RNA、降解RNA（如来自FFPE组织的RNA）和具有已知二级结构的RNA（如病毒基因组）的反转录。

虽然随机引物有助于改善cDNA合成，但它们不适合用于长RNA的全长反转录。增加随机六聚体引物的浓度可提高cDNA产量，但同时也会增加相同模板上与多个位点的结合，从而导致cDNA片段较短（图4）。

此外，随机引物可能不适用于某些RT-PCR应用。例如，高估mRNA拷贝数就是一个需要考虑的问题[5]。两步法RT-PCR经常使用oligo(dT)和随机引物的混合物，结合每种类型引物的优点。在microRNA（miRNA）表达检测中，随机六聚体并不适用，必须为miRNA的反转录设计特殊引物[6,7]。

图4. cDNA的长度和产量受到所选择引物和引物浓度的影响。使用oligo (dT)引物和不同浓度的随机六聚体引物，将具有poly(A)尾的6.4 kb RNA反转录成双链cDNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析结果可以看到，使用oligo（dT）引物可获得更分散、更长的转录产物，相比之下，增加随机六聚体的浓度，可产生更高浓度的短cDNA。

❖ 基因特异性引物可提供特异性最强的反转录引物配对。这些引物是根据目标RNA的已知序列进行设计的。由于引物与特异性RNA序列结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当对多种目标进行分析时，则需要使用更多的RNA样本。基因特异性引物通常用于一步RT-PCR实验应用。

五、主要反应组分

除了反转录酶和引物之外，其它主要反应组分还包括RNA模板（预处理以去除基因组DNA）、缓冲液、dNTP、DTT、RNA酶抑制剂和RNase-free水（图5）。

❖ RNA模板按本文前述方法制备。表4提供了反转录反应的推荐RNA起始量范围，最佳起始量取决于目标序列的普遍性和反转录酶的灵敏性。

❖ 反应缓冲液可维持反应的最佳pH和离子强度。提供的缓冲液还可能含有提高反转录效率的添加剂。

❖ dNTPs通常为0.5-1 mM，最好为等摩尔浓度。推荐使用新鲜稀释的高品质dNTP，以确保良好的反转录效果。

❖ DTT，一种还原剂，通常用于提供最佳的酶活性。如果DTT或其他添加剂发生沉淀，会降低反应效率；因此，应溶解反应组分并充分混匀。

❖ RNA酶抑制剂通常包含在反应缓冲液中或单独被添加到反转录反应中，用于防止RNA降解。RNase可能在RNA分离过程中被共同纯化，或者在反应体系配制期间被引入。已知的RNase有许多种，应根据其作用方式和反应要求选择合适的RNA酶抑制剂。

❖ 反转录反应中使用的水应不含有核酸酶。最好选用商业化供应的无核酸酶水，或经DEPC（焦碳酸二乙酯）处理去除RNase的水。污染RNase不能通过简单的过滤去除，而且由于RNase是热稳定的，无法通过高压消毒去除。

六、反应温度和反应时间

反转录反应包含三个主要步骤：引物退火、DNA聚合和酶失活（图6）。这些步骤的温度和持续时间因选择的引物、目标RNA和使用的反转录酶而异。

❖ 引物退火：将引物与RNA模板混合，加热至65℃并维持5分钟，然后冰浴至少1分钟。这有助于确保RNA保持单链以及引物与靶标有效退火。退火后，加入反转录酶和必需组分（如缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂）。

❖ DNA聚合：在此步骤中，反应温度和持续时间可能会根据所使用的引物和反转录酶而变化。使用oligo (dT)引物（Tm〜35-50 ℃），可以在反转录酶的最佳反应温度（37-50 ℃）下直接孵育反应。随机六聚体引物因其较短的长度，通常具有较低的Tm（〜10-15℃）。因此，当使用随机六聚体引物（单独使用或与oligo（dT）结合使用）时，我们建议在加入酶后，在室温（〜25℃）孵育10分钟以延伸引物。

反转录酶的热稳定性各不相同，而热稳定性决定了每种酶的最佳聚合温度。使用热稳定的反转录酶，可达到更高的反应温度（如50 ℃），有助于高GC或具有复杂二级结构RNA的变性，同时不影响酶活性（图7）。

聚合时间取决于反转录酶的持续合成能力，即单次合成过程中掺入的核苷酸数量。例如，持续合成能力较低的野生型MMLV反转录酶通常需要60多分钟才能完成cDNA合成。相比之下，持续合成能力较高的改良型反转录酶可能只需要10分钟时间，就可以合成9 kb cDNA。

图7. 热稳定性对反转录酶活性的影响。使用oligo（dT）引物和放射性标记dNTPs，对含有不同长度RNA的样本进行反转录。通过凝胶电泳分离反应产物，并通过放射自显影进行显色。热稳定的反转录酶即使在50℃以上也能得到高cDNA产量。

❖ 酶失活：反转录反应的最后一步是将反转录酶失活处理。失活温度范围为70-85 ℃，具体取决于酶的热稳定性。失活通常需要5-15分钟，温度越高，所需时间越短。

七、第一链和第二链cDNA合成

如前所述，从RNA模板合成cDNA，产生cDNA:RNA复合物。该过程被称为第一链cDNA合成。如果存在RNase H活性（如野生型AMV和MMLV反转录酶），则cDNA:RNA复合物中的RNA会在第一链合成期间被切割。第一链cDNA可以直接用于RT-PCR等实验应用中，热稳定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）将复制cDNA的互补链。

在cDNA文库构建和测序中，将第一链cDNA作为模板，获得代表RNA靶标的双链cDNA。这个过程被称为第二链cDNA合成。在第二链cDNA合成中，推荐使用RNase H活性最小的反转录酶，从而最大限度地增加cDNA合成长度和产量。

双链cDNA的合成可以使用多种DNA聚合酶（如T7 DNA聚合酶、DNA聚合酶I、Taq DNA聚合酶）生成cDNA第一链的互补链。以下列举的一些其它酶也可按照Gubler-Hoffman改良方法[8]（图8）用于双链cDNA合成。

❖ E. coli RNase H切割cDNA:RNA复合物中的RNA链，为DNA合成提供3'-OH引物结合位点

❖ E. coli DNA polymerase I利用5′-3′'聚合酶活性延伸切口RNA链，并利用5'-3'外切核酸酶活性沿合成方向替换RNA链，该过程被称为切口平移。

❖ E. coli DNA ligase缝合新合成cDNA片段之间的切口。（T4 DNA连接酶不能用作替代物，因为它会连接钝端双链cDNA片段并形成嵌合结构。）