WB实验干货—实验介绍、蛋白提取、蛋白定量

WB实验干货-实验介绍、蛋白提取、蛋白定量

一、WB实验介绍

WB（Western Blot，蛋白免疫印迹）是一种常规的蛋白分析技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

WB实验的基本核心理念是抗原抗体的特异性反应，通过变性胶 SDS-PAGE 将不同分子量的蛋白质分离开，然后转移到固相载体 PVDF 膜上，再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液进行稀释。待目的蛋白和抗体充分结合后，用 TBST 洗脱液洗脱掉多余未结合的一抗，加入带有 HRP 标记的对应二抗，这样，我们的蛋白+一抗+二抗形成一个复合物，加以化学发光液，有靶蛋白的位置就会产生荧光，利用胶片或者化学发光仪就可以显现靶蛋白的条带显现。

WB常规实验流程：蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱→化学发光→数据分析。

二、WB实验试剂配置

在实验开始之前，可以按以下配方比例配置实验所需试剂。

1.电泳缓冲液 

取 电泳缓冲液干粉（G2018-1L），溶解于 1L 纯水（G4701-500ML）中，置于磁力搅拌器（MS-150）上搅拌充分溶解。

2. 转膜缓冲液 

取 转膜缓冲液干粉（G2017-1L），溶解于 800mL 纯水中，加入 200mL 的甲醇，置于磁力搅拌器上搅拌充分溶解。

3. TBST 缓冲液 

取 TBS 粉剂（G0001-2L），溶解于 2L 纯水中，加入 1mL 吐温20，置于磁力搅拌器上搅拌充分溶解。

4. 5%脱脂牛奶 

称量 5g 脱脂奶粉（G5002-100G），溶解于 100mL TBST 溶液（G0004-500ML）中，置于磁力搅拌器上搅拌至少 30分钟，然后放入 4℃冰箱暂放。

5.完全裂解液

1mL RIPA 裂解液（G2002-100ML或G2033-100ML）+20μL cocktail（G2006-250UL）+10μL磷酸化蛋白酶抑制剂 A（G2007-1ML）+10μL 磷酸化蛋白酶抑制剂 B（G2007-1ML）+10μL PMSF（G2008-1ML），除 RIPA 外，其他四种试剂使用前几分钟加入，现配现用。

三、WB实验步骤

由于文章篇幅限制，小赛这次先介绍组织或细胞的蛋白提取和蛋白定量常规流程。

蛋白提取

1 .组织总蛋白提取

准备好所需要数量的样本管；放入研磨珠，置于冰盒上备用；

组织块先用预冷 PBS洗涤 2-3 次，除去血污，然后放在滤纸上，吸尽多余的 PBS 后放入对应的匀浆管中，加入大约 10 倍样本体积的完全裂解液，置于组织研磨仪中，对称放置，确认放置平衡后，盖好盖子，选择程序开始匀浆。

Tips

① 芝麻大小的组织，一般加入100-200μL 完全裂解液；绿豆大小组织加入 400-600μL 完全裂解液；黄豆大小组织加入 800-1000μL完全裂解液。

② Servicebio三维研磨仪参考参数：2mm 氧化锆珠 8-12颗，频率6.5m/s，时间30s。如果一次匀浆不彻底，可以再次匀浆）。如果组织块比较大，可提前用剪刀将组织块剪碎。

2 悬浮细胞提取蛋白

将细胞连带培养基一起吸入 15mL 离心管（EP-1501-J）中，4℃，2000rpm，离心 5分钟，去掉上清；

加入 1mL PBS 溶液（G4202-500ML）重悬细胞，将细胞转移到 1.5mL 离心管（EP-150-M）中，然后 4℃，2000rpm，离心 5分钟，去掉上清，保留沉淀，重复此步骤 2-3 次（此步骤目的为清洗细胞中残留的培养基）；

根据细胞沉淀的量加入适量的完全裂解液，例如沉淀体积为绿豆大小（大概 10uL 左右）的加入大约 200μL 完全裂解液，加入适量研磨珠，放入研磨仪进行裂解；

裂解完成后，12000rpm，4℃，离心 10分钟，上清即为总蛋白溶液。

3 贴壁细胞提取蛋白

倒掉培养基，沿细胞培养皿侧壁或者培养瓶瓶口慢慢加入 PBS 溶液，轻轻晃动平皿或者培养瓶，然后将细胞培养皿/瓶倾斜放置，用移液枪轻轻吸除残余液体，尽量轻柔，不要将细胞冲掉，清洗 2-3 次，最后一次将残余 PBS 完全吸干；

加入适当体积的完全裂解液（例如六孔板各单孔细胞长满的话，加入大约 250μL完全裂解液），反复晃动细胞培养皿/瓶，让裂解液与细胞完全接触，用细胞刮刀将细胞刮下来，收集后，加入研磨珠，放入研磨仪中进行裂解；

裂解完成后，12000rpm，4℃，离心 10分钟，上清即为总蛋白溶液。

蛋白定量

取适量上述步骤中未变性的总蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量检测试剂盒（G2026-200T；G2026-1000T）测蛋白浓度，蛋白浓度测定方法如下：

A.配制蛋白标准贮备液

取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品（BSA）蛋白标准管中，将25 mg蛋白标准品完全溶解，即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。

B.配制蛋白标准工作液

取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。

C.绘制标准曲线（酶标仪法）

将蛋白标准工作液分别按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理盐水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲线。

D.准备待测样品

将待测的蛋白样品进行适当稀释（可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信），按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。

E.配制BCA显色工作液

将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀，得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存，24 h内使用。每个待测样品需200 μL，建议按需配制，避免浪费。

F.检测

向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL，充分混匀（可将96孔板放在振荡器上振荡30 s），37℃反应30 min后，以标准曲线0号做参比，在562 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。（注：也可以在室温反应2 h，或60℃反应30 min。如果蛋白浓度较低，建议置于60℃反应）

G.计算

以标准曲线中梯度蛋白含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度（μg/mL），再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。

Tips

1. BCA法测定蛋白浓度受温度和时间的影响较大，吸光度值会随着时间的延长或温度升高而变化，如果不能精确控制显色反应的时间和温度，建议每次测定都需要做标准曲线。

2. 在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释，不要一次稀释50倍，以免产生较大误差。

3. 为保证蛋白的精确定量，样品的提取和蛋白标准品的稀释配制最好选用相同的缓冲液，同保证两者检测条件一致。如果缓冲液本身就有较高的背景值，建议使用其他的方法测定。

4. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。